Proteínas implicadas en la apoptosis inducida por el inhibidor de Cdk dinaciclib en células de mieloma humano

El mieloma múltiple (MM) es un tipo de neoplasia que afecta a las células de la médula ósea y se caracteriza por una proliferación anormal y acumulación de células plasmáticas, las cuales producen una inmunoglobulina monoclonal que provoca daños en el organismo. Actualmente, el MM sigue siendo una enfermedad incurable, a pesar de que existen tratamientos quimioterápicos y fármacos dirigidos que han conseguido aumentar la supervivencia de los pacientes con mieloma y mejorar el pronóstico de la enfermedad. Se ha propuesto una nueva estrategia terapéutica basada en inhibir la actividad de los principales reguladores positivos de la progresión del ciclo celular, las quinasas dependientes de ciclinas (Cdks), con la finalidad de impedir la proliferación descontrolada característica de las células tumorales. En este contexto, se ha encontrado una molécula que posee una potente actividad inhibidora de diversas Cdks, y se conoce con el nombre de dinaciclib. En el presente trabajo fin de grado, se ha analizado el efecto citotóxico del dinaciclib y su capacidad para inducir la muerte celular programada o apoptosis en células de mieloma múltiple humano. Además, se han estudiado diversas proteínas de la familia Bcl-2 (reguladoras de la vía intrínseca de la apoptosis) para intentar comprender el mecanismo de acción del dinaciclib por el cual es capaz de inducir apoptosis en células de mieloma. Los resultados obtenidos parecen indicar que la apoptosis inducida por dinaciclib se produce como consecuencia de la disminución de los niveles de la proteína antiapoptótica Mcl-1, que es un factor clave para la supervivencia de las células de MM. Por su parte, las proteínas proapoptóticas solo-BH3 Puma y Noxa parecen no intervenir en dicho mecanismo

Estudio de la inmunogenicidad y mecanismos de muerte celular en nuevas terapias antitumorales. Aplicación al mieloma múltiple

En la investigación oncológica, el estudio de los mecanismos moleculares de muerte celular provocados por la quimioterapia es esencial no sólo para llegar a comprender los mecanismos de acción inherentes de estos fármacos, sino también para idear, optimizar y mejorar nuevos enfoques terapéuticos que permitan atajar las tan temidas recaídas. Además, durante los últimos años, la inmunoterapia ha irrumpido en la clínica como un tratamiento que brinda de una cierta esperanza a los pacientes con cáncer. Hoy en día, los tratamientos antitumorales utilizados o en desarrollo son capaces de inducir muerte celular mediante distintos mecanismos como la apoptosis, necroptosis, muerte celular inmunogénica (ICD), catástrofe mitótica, entre otras. Nuestro objetivo durante este trabajo ha sido estudiar los diferentes mecanismos de muerte celular inducidos por fármacos antitumorales actuales o de reciente introducción en la clínica, así como explorar la naturaleza inmunogénica subyacente a dichos tipos de muerte celular.Por un lado, se ha estudiado la contribución de la catástrofe mitótica en la inducción de muerte celular por agentes antimitóticos, así como los mecanismos de muerte accionados cuando dichos fármacos se utilizan en combinación con miméticos de BH3. Los resultados mostraron la existencia de una gran variabilidad inter- e intraindividual en los comportamientos y destinos celulares en respuesta a los distintos compuestos antimitóticos (barasertib, alisertib, vincristina y docetaxel). No obstante, la combinación de los distintos compuestos antimitóticos ensayados con miméticos de BH3 mostró una potenciación de la citotoxicidad en líneas celulares tumorales adherentes, siendo la muerte celular experimentada dependiente de caspasas y de Bax y Bak. En cuanto al papel de la familia de Bcl-2 en la muerte inducida por estos fármacos, los datos parecen indicar que los miembros anti-apoptóticos de esta familia contribuyen de forma cooperativa y acumulativa. Además, a pesar de que se trata un tema bajo debate, los experimentos con microscopía de fluorescencia en time-lapse sugieren que la duración del arresto mitótico influye en el destino ante dicho bloqueo. Cuando se combinó los compuestos antimitóticos con el mimético de BH3, ABT-737, se aceleraba la muerte celular y aumentaba el porcentaje de células que sucumbían durante la mitosis, especialmente en aquellas combinaciones donde el arresto mitótico era más prolongado. En el caso particular del inhibidor de aurora-B (barasertib), la potenciación de la muerte celular cuando se combinaba con ABT-737 sigue un mecanismo molecular diferente. El tratamiento con barasertib indujo marcadores de senescencia en diversas líneas celulares tumorales y la administración posterior de ABT-737 sensibilizaba de forma efectiva a dichas células induciendo una potente respuesta citotóxica. Por otro lado, en este trabajo se ha estudiado la inmunogenicidad y los mecanismos de muerte celular inducidos por la combinación de inhibidores del proteasoma con inhibidores de autofagia o compuestos inductores de estrés en el retículo endoplasmático en diversos modelos de mieloma múltiple. A pesar de que las terapias actuales han conseguido extender la esperanza de vida de esta enfermedad, sigue siendo una neoplasia incurable. En concreto, aunque los inhibidores de proteasoma han demostrado una validada eficacia clínica, la resistencia a estos fármacos sigue siendo recurrente y abarca la mayoría de las recidivas. Esta situación por tanto exige que se diseñen y estudien nuevos esquemas terapéuticos para abordar las recaídas. Así, en un trabajo previo del grupo se demostró la capacidad del inhibidor de autofagia cloroquina para potenciar la muerte celular inducida por carfilzomib. Durante este trabajo, se ha logrado observar también una intensificación similar de la muerte celular en las diferentes líneas celulares humanas y murinas analizadas. Además, la capacidad citotóxica mejorada de esta combinación también se ha constatado en una amplia colección de muestras primarias de médula ósea aisladas de pacientes con mieloma múltiple. De manera similar a lo que ocurre con la cloroquina, también hemos observado que el DBeQ, inhibidor de VCP/p97, también aumenta notablemente la muerte celular inducida por carfilzomib tanto en líneas celulares de MM como en células de mieloma primarias aisladas de la médula ósea de pacientes con esta enfermedad. Además, nuestros resultados indican que las combinaciones de carfilzomib con CLQ o DBeQ no sólo potencian, sino que también aceleran la muerte celular. Sin embargo, el mecanismo de acción por el cual se provoca dicha potenciación no se ha aclarado completamente. Los resultados de este trabajo mostraron que estos tratamientos aumentaban la expresión de varios marcadores de la respuesta a estrés en el retículo. No obstante, dicha respuesta, dependía estrechamente del tiempo y variaba sustancialmente entre las distintas líneas celulares de mieloma. La familia Bcl-2 ocupa una posición trascendental en las respuestas mediadas por estrés en el ER. A este respecto, nuestros datos revelaron una acumulación temprana transitoria de diversos miembros tanto anti- como proapoptóticos de esta familia (Mcl-1, Bim, PUMA y en menor medida NOXA). No obstante, nuestros datos mostraron que la línea celular deficiente para Bim sólo ofrecía una protección parcial contra la muerte celular inducida por los fármacos utilizados. Por lo tanto, su deficiencia podría estar compensada por otros miembros de BH3 capaces de desencadenar la muerte celular tras el tratamiento farmacológico. Por otro lado, aunque todavía no se conoce con exactitud el mecanismo molecular responsable de la muerte celular inducida por estrés en el ER, existen pruebas de la participación tanto de la vía de los receptores mortales como de la vía intrínseca de la apoptosis. Para instigar la muerte celular por la vía canónica, se requiere la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MOMP) inducida por la oligomerización de Bax y Bak. Sin embargo, nuestros datos han demostrado la capacidad de las combinaciones de fármacos utilizadas de inducir la muerte celular en células deficientes en Bax y Bak. Así mismo, la muerte celular inducida por las combinaciones basadas en carfilzomib era dependiente de caspasas en la mayoría de las líneas celulares analizadas, aunque la contribución relativa de cada miembro de esta familia variaba con las diferentes líneas celulares utilizadas. Aunque precisa de un estudio más detallado, los datos obtenidos en este trabajo parecen indicar que la autofagia no juega un papel principal en la potenciación ejercida por la cloroquina sobre la muerte inducida por carfilzomib en nuestros modelos experimentales. En su lugar, los datos apuntan a que la cloroquina pueda ejercer de modulador alostérico sobre el proteasoma potenciando la inhibición de este cuando se utiliza en combinación con carfilzomib. En cuanto al estudio de la capacidad inmunogénica de estos tratamientos, se observó que in vitro, las combinaciones de fármacos eran capaces de inducir la expresión de diversas señales inmunogénicas (expresión de ecto-CRT, Hsp70 y BiP), así como la maduración de células dendríticas cuando estas eran coincubadas con restos apoptóticos de células tratadas con las formulaciones ensayadas. Sin embargo, las respuestas in vivo en los experimentos de vacunación en el modelo ortotópico de mieloma murino MOPC315.BM mostraron que la muerte celular provocada por la combinación de carfilzomib con cloroquina no proporcionaba un efecto protector contra el desarrollo de la enfermedad. Tan solo cuando la combinación de fármacos utilizada para tratar las células de mieloma contenía el inhibidor general de caspasas zVAD-fmk, se consiguió retrasar de forma débil el desarrollo del mieloma. Tal y como apuntan algunos estudios, esto podría indicar que las caspasas juegan un papel en la inmunogenicidad de la muerte celular. A la vista de nuestros datos, la emisión de DAMPs por sí misma podría no ser suficiente para provocar respuestas inmunitarias activas contra el cáncer. De hecho, se considera igualmente decisivo los mecanismos subyacentes involucrados en la recepción, transmisión y respuesta de las células inmunes a estas señales de peligro, así como la propia naturaleza inmunosupresora de esta enfermedad. Una de las razones detrás de la disfunción inmune observada en el mieloma múltiple está mediada por la regulación negativa ejercida por las proteínas inhibidoras del punto de control como el eje PD-1/PD-L1. Sin embargo, ni el tratamiento individual con anticuerpos monoclonales dirigidos contra los inhibidores del punto de control (anti-PD1), ni su combinación con la formulación de vacunación antes mencionada, extendían significativamente la supervivencia de los ratones. Es posible que redes moleculares mas complejas estén involucradas en la generación de una respuesta inmune antitumoral efectiva en la enfermedad de mieloma.Por último, cada vez se está consolidando más la idea de que los DAMPs y los procesos moleculares relacionados con la muerte celular inmunogénica puedan servir como una fuente de biomarcadores pronósticos en pacientes con cáncer. En este trabajo hemos demostrado por primera vez que las células de mieloma en muestras de médula ósea aisladas de pacientes con discrasias de células plasmáticas, muestran niveles elevados de ecto-CRT en su superficie. Además, aunque se observó una gran variabilidad interindividual, nuestros datos sugieren que los niveles de ecto-CRT parecen aumentar con la progresión de la enfermedad. Este hallazgo junto con el hecho de que los pacientes con un perfil citogenético alterado mostraron niveles aumentados de ecto-CRT y que la exposición a la CRT aparentemente no está influenciada por la quimioterapia, puede apuntar a la transformación maligna como el instigador principal de la expresión aumentada de este DAMP. Así mismo el análisis del microambiente en la médula ósea de estos pacientes mostró que los pacientes con niveles altos de ecto-CRT exhibían un perfil de células T alterado, con ratios bajos de células T CD4+/CD8+ consecuencia de una menor frecuencia de linfocitos T CD4+ y un mayor número de células T CD8+. Además, también presentaban un mayor número de células NK, mDC, pDC y Tregs, así como una mayor actividad en el eje PD-1/PD-L1. Así, nuestros datos sugieren que los pacientes con una mayor expresión de este DAMP, poseen rasgos inmunológicos reminiscentes de un microambiente medular óseo asociado a un estado inmunitario debilitado y comprometido, lo que podría traducirse en un mal resultado clínico en el contexto de la enfermedad. De hecho, el grupo de pacientes con un perfil de expresión de ecto-CRT aumentado exhibieron significativamente un menor tiempo medio de progresión de la enfermedad, desarrollaban con mayor frecuencia plasmacitomas extramedulares, habían sido tratados con un mayor número de líneas de tratamiento y albergaban un perfil citogenético de alto riesgo. Todo ello sugiere que la elevada expresión de ecto-CRT en las células de mieloma de estos pacientes está relacionada con una mayor malignidad, un microambiente inmunitario en la médula más deficiente y con un peor pronóstico clínico.<br /

Estudio de la apoptosis inducida por el inhibidor de Farnesil-Transferasas BMS-214662, APO2l/Trail e interferón alfa en el mieloma múltiple humano. Aplicaciones terapeúticas

El trabajo recogido en esta Tesis pretende contribuir a una mejor caracterización de los mecanismos mediante los cuales diferentes agentes terapeúticos BMS-214662, Apo2L/TRAIL e Interferón-alfa) en líneas celulares de mieloma múltiple (MM) y en células plasmáticas tumorales extraídas de pacientes de mieloma. El MM, como su propio nombre indica, es un "oma" o tumor que afeca a la "myelo" médula, y que actualmente continúa siendo incurable. La gran heterogeneidad existente entre los pacientes en cuanto al grado de afectación, la evolución de la enfermedad, la respuesta a los tratamientos... obstaculizan la obtención de terapias eficaces.Se hace necesaria una búsqueda de nuevos tratamientos, la caracterización de los mecanismos apoptóticos que inducen y de los parámetros que condicionan la sensibilidad de las células a dichos agentes, todo ello, con el objetivo de diseñar una terapia más efectiva, individualizada y racional.<br /

Estudio de la apoptosis inducida por el inhibidor de proteasoma ixazomib en células de mieloma. Evaluación de factores de resistencia y análisis de su potenciacion por agonistas BH3

El mieloma múltiple constituye el 10% de las neoplasias hematológicas y se caracteriza por la proliferación descontrolada y acumulación en la médula ósea de células B plasmáticas. A pesar de todos los tratamientos aprobados recientemente contra esta enfermedad, el mieloma múltiple sigue siendo incurable. El tratamiento con mejor resultado hasta la fecha es el uso de inhibidores de la subunidad ß5 del proteasoma 26S. El primer inhibidor del proteasoma introducido en la clínica fue bortezomib, un inhibidor reversible de la subunidad ß5 del proteasoma, pero con efectos secundarios y resistencias. Para salvar las resistencias generadas por bortezomib se introdujo en la clínica el inhibidor irreversible del proteasoma, denominado carfilzomib. Ese último, al igual que bortezomib, también genera resistencias, por lo que se aprobó un tercer inhibidor de proteasoma, denominado ixazomib. Ixazomib es un inhibidor reversible de la subunidad ß5 del proteasoma, como bortezomib, pero con características muy similares a carfilzomib. Se ha descrito con anterioridad su capacidad de generar apoptosis en células de mieloma, pero se desconoce precisamente el mecanismo por el cuál actúa. Paralelamente al uso en la clínica de los inhibidores de proteasoma, se están desarrollando pequeños compuestos similares a las proteínas BH3-only implicadas en la apoptosis. Se desconoce si su empleo junto a los inhibidores de proteasoma potencia la apoptosis y si dicha combinación sería capaz de contrarrestar las resistencias generadas por los inhibidores de proteasoma solos. En este trabajo hemos analizado el mecanismo de apoptosis inducida por ixazomib en células de mieloma y el posible papel de la autofagia en el tratamiento con ixazomib. También la apoptosis inducida por la combinación de ixazomib y los miméticos BH3 tanto in vitro como in vivo en células de mieloma. Hemos descubierto que la apoptosis en las células de mieloma múltiple inducida por ixazomib se realiza no solo por la vía intrínseca sino también por la vía extrínseca, y su efecto tóxico se ve potenciado al combinar el IP con miméticos BH3 in vitro, mientras que en muestras ex vivo de pacientes con MM produce un efecto aditivo. Aunque todavía falta realizar más estudios sobre los resultados obtenidos, los datos sugieren que sería útil introducir estas combinaciones de fármacos en la clínica. <br /

Generación de una línea transfectante de mieloma múltiple humano que sobreexprese la proteína antiapoptótica Mcl-1

El mieloma múltiple es un tipo de cáncer hematológico caracterizado por la proliferación maligna y acumulación de células B plasmáticas en la médula ósea. Aunque las nuevas terapias han mejorado de manera significativa la tasa de supervivencia de los pacientes, el mieloma múltiple sigue siendo una enfermedad incurable.Mcl-1 es una proteína multidominio antiapoptótica de la familia de las proteínas Bcl-2 que se encuentra frecuentemente sobreexresada en múltiples tumores, incluyendo el mieloma múltiple. Por esto, Mcl-1 podría ser una diana terapéutica para el tratamiento del mieloma. Por otra parte, entre las nuevas estrategias terapéuticas en desarrollo se encuentran los inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (Cdks), las cuales juegan un papel importante en la regulación de la progresión del ciclo celular y en otros procesos, como la transcripción. En este contexto, se ha descrito una molécula conocida como dinaciclib que actúa como inhibidor de varias Cdks. La inhibición de Cdk9 provoca una regulación negativa de la transcripción de proteínas de vida media corta, como Mcl-1, disminuyendo su expresión e induciendo apoptosis.En el presente Trabajo Fin de Grado se ha pretendido generar una línea de mieloma múltiple que sobreexpresara dicha proteína antiapoptótica. De esta manera, se podría disponer de un modelo celular de resistencia a la apoptosis in vitro para estudiar el efecto de posibles fármacos anti-tumorales cuya diana sea esa proteína. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la sobreexpresión de Mcl-1 disminuye los niveles de apoptosis inducidos por el dinaciclib. <br /

Análisis del mecanismo de acción de nuevos fármacos para el posible tratamiento de neoplasias hematológicas. Efecto del inhibidor de CK2, CX-4945, en células de mieloma múltiple

La proteína Ser/Thr quinasa CK2 se conoce que está implicada en varios procesos celulares como el ciclo celular, apoptosis y proliferación. Se ha estudiado que la inhibición de CK2 inducida por una molécula recientemente descubierta, CX-4945, muestra efectos anti-proliferativos y pro-apoptóticos en diferentes canceres, incluidos en mieloma múltiple. El MM es una neoplasia hematológica que afecta a las células B plasmáticas, la cual sigue siendo incurable. En este trabajo se analizó, sobre varias líneas celulares de mieloma múltiple, la capacidad de inducción y el mecanismo de muerte celular y la combinación con un inhibidor del mTOR. Los resultados mostraron que CX-4945 induce apoptosis en todas las líneas de MM analizadas, a partir de las 8h de incubación, y que todas ellas, excepto MM1.S, eran sensibles en grado variable al inhibidor de caspasas, Z-VAD-fmk. La apoptosis inducida por el inhibidor de CK2, en la línea MM.1S, mostró que era independiente de caspasas, mientras que en las líneas RPMI 8226 y U266, fue dependiente de caspasas, y en concreto se observó que la caspasa-8, era la caspasa iniciadora. En esta última línea celular aunque expresaba niveles significativos de DR4 y tras el tratamiento con CX-494,5 se inducía la expresión de TRAIL y FasL, la unión de estos a sus receptores mortales específicos no contribuían a la muerte inducida por el fármaco. CX-4945 inducía exposición de PS y caída del potencial mitocondrial y estos hechos no fueron completamente inhibidos por la sobreexpresión de Bcl-xL y Mcl-1 en células RPMI 8226. La necroptosis, necrosis programada, podría contribuir a la muerte inducida por el CX-4945 en las líneas celulares MM.1S y NCI-H929. El inhibidor de mTOR, PP242, disminuye la acción citotóxica del CX-4945 en las líneas celulares de mieloma, U266 y NCI-H929

Autofagia y apoptosis en líneas de mieloma deficientes en la expresión del gen Atg5

El final de la vida celular puede darse por tres mecanismos diferentes: muerte por apoptosis, muerte mediada por autofagia y muerte por necrosis. Este estudio recoge el análisis del segundo proceso y su importante función como alternativa a la apoptosis. La autofagia es un proceso catabólico natural en el que la propia célula degrada y recicla orgánulos deteriorados, así como proteínas, macromoléculas citoplasmáticas y otras sustancias que podrían desembocar en la muerte celular, mediante vesículas de doble membrana denominadas autofagosomas. Juega un papel esencial en la adaptación y supervivencia celular frente a condiciones adversas. Para el desarrollo del trabajo se ha inducido estrés por ausencia de glucosa en una línea celular deficiente en autofagia, la línea MM.1S ShAtg5. La línea modificada genéticamente presenta silenciado el gen ATG5 por lo que no expresa la proteína que lleva el mismo nombre, componente principal de las membranas autofagosómicas. Como control se ha empleado la línea wildtype MM.1S. Todos los experimentos han sido llevados a cabo de manera paralela en un medio suplementado con glucosa. Los resultados de estudiar la densidad celular en una curva de crecimiento, la muerte por apoptosis con citometría de flujo y la expresión de proteínas autofágicas mediante un Western Blot determinan una sorprendente adaptación de las células deficientes en la expresión de ATG5 a las condiciones desfavorables del medio sin glucosa. Dicho hallazgo pone en duda el estrés causado por la ausencia de glucosa así como el imprescindible papel de la proteína ATG5

Apoptosis inducida por el inhibidor del proteasoma Ixazomib en células de mieloma humano

El mieloma múltiple humano es una neoplasia hematológica caracterizada por una proliferación maligna de células B plasmáticas productoras de ingentes cantidades de anticuerpos, procedentes de un solo clon y cuya expansión tiene lugar en la médula ósea. A pesar de los avances realizados en la terapia frente a esta patología, continúa siendo una enfermedad incurable. El estudio del mecanismo de acción de nuevos fármacos introducidos para el tratamiento del mieloma múltiple podría aportar información útil en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas. El presente trabajo aborda el análisis de las vías de muerte celular implicadas en la acción del inhibidor del proteasoma Ixazomib, recientemente aprobado por la FDA y la EMA. En concreto, se ha comprobado la capacidad de Ixazomib de inducir muerte celular de manera dosis-dependiente en diversas líneas de mieloma múltiple, así como su efecto sobre el ciclo celular provocando, en la mayoría de las líneas celulares estudiadas, una parada en las fases G2/M. Además, ha quedado demostrada la activación de caspasa 3, principal caspasa ejecutora, en células tratadas con Ixazomib y la variación en los niveles de expresión de proteínas pertenecientes a la familia Bcl-2, lo cual podría indicar su directa implicación en el mecanismo de muerte celular desarrollado por éste. En paralelo, se ha descartado la posible sinergia entre Ixazomib e inhibidores de VCP/p97 (DBeQ y CB-5083) pero ha quedado constatada una clara sinergia entre Ixazomib y cloroquina que, en un futuro, podría constituir una nueva estrategia terapéutica de combinación frente al mieloma múltiple

Estudio del mecanismo de muerte celular inducida por Dinaciclib en células de mieloma múltiple

El mieloma múltiple (MM) es un cáncer hematológico que se caracteriza por la proliferación maligna de las células B plasmáticas que se expanden y acumulan en la médula ósea. A pesar de los avances realizados en el último par de décadas en el tratamiento de esta enfermedad, el MM sigue siendo incurable. El estudio de la biología de las células plasmáticas tumorales ha puesto de manifiesto que la desregulación del ciclo celular permite el desarrollo del cáncer. Las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs) regulan el progreso a través de las etapas del ciclo por lo que se han desarrollado fármacos, como el dinaciclib, que inhiben las CDKs e inducen la apoptosis. En este trabajo fin de grado, se ha analizado el efecto citotóxico mediante el cual el dinaciclib, solo o en combinación con inhibidores de proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 (claves en la regulación de la supervivencia), induce muerte celular en varias líneas de MM humano. Además, se ha estudiado el efecto del dinaciclib sobre dichas células para determinar en qué fase del ciclo se produce el arresto celular previo a la muerte celular. Por último, se ha examinado como influye el dinaciclib en la expresión de varias proteínas de la familia Bcl-2. Los resultados obtenidos indican que el arresto celular se produce en la fase S o G2/M, según la línea celular, y sugieren que el mecanismo mediante el cual el dinaciclib induce apoptosis consiste en reducir la expresión de Mcl-1 para que proteínas proapoptóticas, como Bim y Puma, inicien la muerte celular programada. Por otro lado, la combinación de dinaciclib con inhibidores de Mcl-1 y Bcl-XL muestra que podría ser una futura terapia puesto que, aunque los resultados difieren según la línea celular, presenta efecto sinérgico en las líneas MM1S, U266 y RPMI8226

Visualización de las interacciones entre proteínas de la familia BCL-2 mediante BIFC en células vivas

La apoptosis es un proceso esencial para mantener la homeostasis tisular y fallos en su regulación dan lugar a patologías, como procesos tumorales. El tratamiento actual de muchos tumores se basa en drogas citotóxicas que inducen muerte celular por la ruta mitocondrial de la apoptosis. Las señales desencadenadas por estos agentes convergen en la mitocondria y producen la liberación de factores apoptogénicos como el citocromo c que junto a la proteína Apaf-1 forma el complejo apoptosoma [1], capaz de activar la caspasa 9 iniciadora, que a su vez activa a las caspasas ejecutoras 3 y 7 las cuales llevarán a cabo la proteolisis de distintos sustratos celulares. Otro factor apoptogénico es AIF (Factor Inductor de Apoptosis), capaz de causar la condensación de cromatina independientemente de la acción de las caspasas [2]. La fase inicial de la ruta intrínseca de la apoptosis está regulada por las proteínas de la superfamilia Bcl-2 [3]. Dentro de esta superfamilia se encuentran proteínas antiapotóticas (Bcl-2, Mcl-1, Bcl-XL), proapoptóticas multidominio (Bak, Bax) y proapoptóticas sólo-BH3 (Bim, PUMA, Noxa, Bik, Bid), que solamente comparten con el resto de miembros el dominio de homología BH3. Las interacciones entre los miembros de esta familia regulan la activación de las proteínas Bak y Bax y posterior permeabilización de las membranas mitocondriales. Sin embargo, no se ha podido caracterizar completamente el mecanismo molecular por el que ocurre esta activación ni cómo las moléculas efectoras oligomerizan para llevar a cabo la permeabilización de las membranas. Existe un modelo de activación indirecta que propone que las proteínas antiapoptóticas actúan neutralizando a Bak y Bax, y que las proteínas sólo-BH3 que se inducen por estímulos apoptóticos, cuando se unen a las antiapoptóticas liberan a las moléculas efectoras activas [4, 5]. Otro modelo totalmente opuesto defiende la capacidad de ciertas proteínas sólo-BH3, denominadas activadoras y entre las que se ha propuesto a Bim, Bid y más recientemente PUMA y Noxa, de unirse de manera directa a Bak y Bax y causar su activación, cuando son liberadas de las antiapoptóticas por unión a éstas de los miembros sólo-BH3 sensibilizadores (Bad, Bik) [6, 7]. Datos previos de nuestro laboratorio muestran que la presencia de las proteínas Bak y Bax es esencial para la sensibilidad de las células a estímulos apoptóticos [8]. El trabajo con neoplasias hematológicas ha permitido observar que la apoptosis inducida por fármacos antitumorales hace aumentar los niveles de proteínas proapoptóticas como PUMA [9] o Bim [10]. También se ha visto el aumento de expresión de Bim tras el tratamiento con glucocorticoides, que hace exceder la capacidad de bloqueo de dicha proteína por Mcl-1 [11], quedando por lo tanto moléculas de Bim libres para activar a proteínas efectoras. El objetivo principal de mi trabajo de tesis doctoral ha sido estudiar las interacciones entre las proteínas de la familia Bcl-2, mediante la técnica de Complementación de Fluorescencia o BiFC. Esta técnica se basa en la formación de complejos fluorescentes por asociación de dos fragmentos de una proteína fluorescente cuando éstos se encuentran suficientemente próximos debido a la interacción de dos proteínas a las que dichos fragmentos se encuentran fusionados [12, 13]. En la literatura existen varios trabajos sobre las interacciones entre miembros de la familia Bcl-2. Sin embargo, la mayoría de datos se han obtenido con péptidos sintéticos y en sistemas libres de células. Mediante esta técnica, hemos podido caracterizar una serie de interacciones empleando las proteínas enteras y en modelos celulares. Además, esta técnica permite estudiar interacciones débiles o transitorias, difícilmente detectadas por otras técnicas. Hemos utilizado los vectores pBiFC-VN173 (que contiene el fragmento amino de la proteína Venus) y pBiFC-VC155 (con el fragmento carboxilo de la misma proteína fluorescente). Hemos generado un primer conjunto de proteínas de fusión de manera que los cDNA correspondientes a las proteínas Bim, PUMA, Noxa, Bak y Bax se han fusionado al fragmento VN173 y las proteínas Bak, Bax, Mcl-1 y Bcl-XL se fusionaron al fragmento VC155. Además, hemos generado una serie de mutantes de delección del dominio BH3 en las proteínas Bim, PUMA, Bak y Bax, de la primera hélice alfa en Bak y Bax y un mutante de sustitución de un aminoácido del dominio BH3 de Noxa (NoxaL29E), para evaluar la implicación de estas regiones de las proteínas en las interacciones con las distintas parejas. Hemos optimizado las condiciones de transfección de células HeLa y HCT116 con Lipofectamina y hemos evaluado en todos los casos los niveles de expresión de las proteínas de fusión respecto a las endógenas. Hemos empleado un tercer vector que contiene la proteína mRFP que nos ha servido de control interno de transfección. De esta manera, hemos podido calcular por citometría de flujo el porcentaje de células que presentan complejos fluorescentes así como la intensidad media de fluorescencia de la señal de BiFC respecto de la de mRFP. También hemos analizado la localización subcelular de los complejos por microscopía confocal y en determinados casos se ha analizado la formación de los complejos a lo largo del tiempo por microscopía de ¿time-lapse¿. Los resultados se han confirmado utilizando un segundo conjunto de vectores, en los que se ha intercambiado el fragmento (VN o VC) al cual se encuentra fusionada cada proteína. Por otra parte, se ha evaluado la influencia de la posición donde se fusiona el fragmento de la proteína fluorescente en algunas proteínas. Para ello se han generado líneas estables por infección retroviral derivadas de HeLa que sobreexpresan las proteínas EYFP-Mcl-1, Mcl-1-EYFP, EYFP-Bcl-XL y Bcl-XL-EYFP y se han realizado transfecciones transitorias para las fusiones EYFP-Bax y Bax-EYFP. El análisis por microscopía confocal ha permitido ver que solamente la localización de Bcl-XL se encuentra alterada cuando tiene su extremo carboxilo bloqueado. Por ello, se generó un nuevo vector que contiene la fusión VC155-Bcl-XL. Nuestros resultados indican que las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 y Bcl-XL se unen preferentemente a las proteínas sólo-BH3 Bim, PUMA y Noxa, interacción requiere la presencia del dominio BH3 de las segundas. También se ha podido detectar interacción de los miembros antiapoptóticos con Bak y Bax aunque en menor porcentaje de células y con complejos de menor intensidad de fluorescencia y se ha visto la implicación de los dominios BH3 de las segundas en estas interacciones. Cabe destacar que además hemos podido detectar la interacción de las proteínas sólo- BH3 Bim, PUMA y Noxa tanto con Bak como con Bax, lo cual apoyaría la capacidad de éstas de activar a las segundas por unión directa, un tema muy debatido en la literatura. Es interesante mencionar que los estudios de microscopía confocal y de ¿time-lapse¿ han revelado la formación de estos complejos en células que posteriormente adquieren fenotipo apoptótico. Los complejos Bim/Bax aparecen inicialmente en el citosol y se translocan a continuación a las mitocondrias. Nuestros resultados además, confirman la importancia del dominio BH3 de las proteínas sólo-BH3 a la hora de interaccionar con las proteínas multidominio Bax y Bak, viéndose la formación de los complejos fluorescentes significativamente reducida al deleccionar o modificar esta región de la proteína. Hemos obtenido también resultados interesantes acerca de la zona en la que las proteínas Bim, PUMA y Noxa se unen a Bak y Bax. Nuestros datos indican que la primera hélice de Bax es el lugar de unión de las proteínas sólo-BH3, coincidiendo con datos publicados anteriormente [14, 15], mientras que tanto esta región como el dominio BH3 de Bak son necesarios para estas interacciones. Hemos obtenido datos sobre la dimerización de Bak que indican la importancia de su dominio BH3 en este proceso, mientras que para Bax nuestros resultados sugieren la implicación de su primera hélice alfa. Estos datos ponen de nuevo en evidencia diferencias importantes en el proceso de activación y oligomerización de estas proteínas. Además, hemos generado líneas estables por infección retroviral derivadas de HeLa que sobreexpresan las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 y Bcl-XL. Hemos comprobado por citometría de flujo que las interacciones de las proteínas sólo-BH3 con Bak/Bax se ven reducidas tanto en porcentaje de células como en intensidad de los complejos y las imágenes de microscopía time-lapse han permitido comprobar que existe un retraso en la formación de estos complejos. Datos preliminares obtenidos mediante la técnica BiFC multicolor, han permitido observar la existencia de una competición entre proteínas antiapoptóticas y Bak/Bax por unirse a las proteínas "solo-BH3"